文章内容
英文标题：Differential expression of miRNA in Carassius auratus gibelio in response to cyprinid herpesvirus 2 infection
中文标题：感染鲫鲤疱疹病毒2的银鲫中miRNA的差异表达
发表期刊：Developmental and Comparative Immunology
影响因子：2.913
发表单位：上海海洋大学
技术手段：miRNA测序
miRNA是一类内源性非编码RNA，参与真核生物中靶基因的转录后调控。众所周知，miRNA在病原体感染的调节中发挥着重要作用，近年来已发现越来越多的与宿主-病原体相互作用相关的miRNA，然而，对硬骨鱼中宿主-病毒相互作用中miRNA功能的研究很少。
银鲫是中国主要的淡水养殖物种。然而，在2011年，由CyHV-2病毒引起的新型传染性病导致中国银鲫死亡率升高。因此，迫切需要控制CyHV-2病毒感染的策略。目前，已报道许多免疫相关基因可对银鲫中的CyHV-2病毒感染起反应。与此同时，银鲫鱼的转录组已构建完成，这有助于证明病毒miRNA在针对病原体的免疫防御中的各种作用。免疫相关miRNA的鉴定和比较分析对于进一步研究其生理或病理功能以及对多种病原体感染的先天性和适应性免疫应答的调节是必不可少的。
在这项研究中，研究人员使用高通量测序技术在未感染和CyHV-2感染的条件下从银鲫的肾脏构建了两组小RNA（sRNA）文库。 同时，进一步研究了23种差异表达的miRNA。 生物信息学分析阐明了23种差异表达的miRNA的靶基因和功能。 该研究的miRNA的整合分析可以提供对miRNA介导的免疫应答调节机制的更多了解。
取材：将银鲫在23℃的环境下饲养驯化，七天后将银鲫分为两组进行试剂注射，处理后将未感染组和感染组（注射后72h）的肾脏组织取出作为样本，利用液氮冷冻保存。
1. 小RNAs文库构建和小RNA测序
2. 分析差异表达的miRNA（使用Fisher精确检验，卡方检验，卡方检验，t检验）
3. 通过qRT-PCR验证miRNA表达
4. miRNA靶基因的预测（TargetScan 50和miRanda3.3a、KEGG注释）
1. 鉴定保守的miRNA和新的候选miRNA
本次实验共鉴定银鲫的888个miRNA，84个miRNA的表达相对较高，497个miRNA的表达水平相对较低。研究表明miRNA的表达水平表现出广泛的范围。 此外，鉴定了48种推定的新型miRNA。 新miRNA的reads处于相对较低的水平，可能表明推定的新miRNA的表达水平较弱，而已知miRNA的表达较高，这与其他物种中观察到的现象一致。
2. 鉴别和验证差异表达的miRNA（DE-miRNA）
与未感染组的miRNA表达水平相比，25种miRNA显著差异表达（p <0.1）。研究人员选择了相对高表达的25个DE-miRNA用于qRT-PCR验证。结果显示，这15种miRNA的表达谱具有与高通量测序分析相似的表达模式（图1），通过qRT-PCR分析未检测到10种miRNA，可能的原因是这些miRNA的丰度较低。
3. 橙斑石斑鱼miRNA假定靶基因的预测和富集分析
miRNA及其靶标的鉴定对于理解miRNA的生理功能至关重要。表1中的预测数据显示，许多miRNA（agi-miR-146a-3p，agi-miR-725，agi-miR-181a-3p，agi-miR-2187-5p和agi-miR-26a除外2-3p）具有多于一种预测的靶基因。KEGG富集分析表明，靶基因参与免疫过程，包括趋化因子信号传导途径，细胞凋亡，Jak-STAT信号传导途径和TGF-b信号传导途径。
图1 通过qRT-PCR验证16种DE-miRNA的相对表达水平
参考文献Jianfei Lu,Dan Xu,et al. Differential expression of miRNA in Carassius auratus gibelio in response to cyprinid herpesvirus 2 infection. Developmental and Comparative Immunology, 2018.