食管鳞状细胞癌（ESCC）患者常因淋巴结转移而面临严峻预后。然而，关于ESCC转移性淋巴结的细胞和分子特性的全面理解仍然难以实现。在这项涉及12名转移性ESCC患者的研究中，我们采用了单细胞测序、空间转录组学（ST）和多重免疫组化学（mIHC）技术，探索原发肿瘤样本、邻近组织、转移性和非转移性淋巴结的空间和分子属性。对161333个细胞的分析显示，上皮细胞中有特定亚簇在转移性淋巴结中显著富集，表明具有促转移特性。此外，肿瘤微环境中的间质细胞，包括MMP3+IL24+成纤维细胞、APLN+内皮细胞和CXCL12+周细胞，也被认为通过血管生成、胶原蛋白生成和炎症反应参与ESCC转移。处于循环状态的CD8+ T细胞在转移性淋巴结中尤为常见，表明其在促进转移中具有潜在作用。我们识别出不同的细胞间通信网络和特定的配体-受体通路。我们的发现通过空间转录组图谱和mIHC得到了验证。本研究加深了我们对ESCC患者转移性淋巴结细胞和分子层面的理解，为这些患者提供潜在的新治疗策略见解。

scRNA-seq、Visum

1.通过scRNA测序和空间转录组学揭示的ESCC表征

为全面阐明ESCC的细胞特性，我们对12名ESCC患者通过手术获得的29个样本进行了scRNA-seq分析，包括12个肿瘤样本、6个邻近正常组织、4个转移性淋巴结和7个非转移性淋巴结（图1a）。共计对161333个高质量细胞进行了以下分析，其中61928个细胞来自肿瘤样本，29518个来自邻近正常组织的细胞，49966个来自淋巴结的细胞，以及19921个来自转移性淋巴结的细胞。根据已知标志物鉴定了12种主要细胞类型（图1b，c），包括T细胞、B细胞、浆细胞、肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、周细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞。此外，我们的结果显示，T细胞的分数和B细胞在淋巴结中的比例远高于其他样本，而转移性淋巴结中上皮细胞的比例最高（图1d）。此外，利用一名转移性ESCC患者的肿瘤样本，揭示了ESCC的空间转录组特征，并在ST切片上标注了每种主要细胞类型（图1e）。总体而言，我们揭示了ESCC组织的细胞组成和空间特征，便于后续对转移相关细胞亚群的分析。

2.转移性ESCC中具有促进转移特征的上皮细胞

从肿瘤样本、正常组织和转移性淋巴结中识别出16416个恶性上皮细胞。共分类了3个上皮细胞亚簇，其中大多数起源于肿瘤样本和转移性淋巴结（图2a，b）。大多数来自邻近组织的上皮细胞为ME1亚簇，表明ME1亚簇的恶性潜力相对较低。ME2和 ME3亚簇主要从肿瘤样本和转移性淋巴结中采集，表明ME2和ME3亚簇可能具有较高转移潜力。与邻近组织获得的上皮细胞相比，转移性淋巴结获得的上皮细胞CNV评分远高于此（图2c）。每个亚簇的关键标记基因如图2d。此外，我们的发现显示ME1亚群在三个亚群中恶性评分最低，非恶性分数最高，这意味着ME1亚群的恶性潜能较低（图2f）。我们评估了这些基因在上皮细胞中的表达水平，这些基因来自ESCC、邻近组织和转移性淋巴结，随后选择了在转移性淋巴结中高度表达的基因作为促转移基因（图2e）。与转移性淋巴结的功能相比，显示原发肿瘤的药物代谢和耐药性高度富集（图2g）。在组织学层面，肿瘤区域在H&E图像和ST特征图中确定（图2h）。根据促转移特征，识别出特定的转移相关区域，并在转移相关区域周围发现血管，表明新血管的招募可能是ESCC转移的关键。mIHC图像显示，上皮细胞的标记基因（EPCAM、DSP和TXNRD1）在肿瘤区域，尤其是转移相关区域高度表达（图2i）。通过空间分析和mIHC验证了所选基因，上述结果显示TXNRD1在促转移区域高度表达。

3.mCAF1（MMP3+IL24+）通过降解细胞外基质促进血管新生，促进了ESCC转移

细胞外基质（ECM）在塑造癌症进展和促进转移中发挥显著作用。随后，我们研究了癌症相关成纤维细胞（CAFs）的亚群。根据先前的研究，我们将14248个CAFs归为两个主要亚群：iCAF和mCAF（图3a）。iCAF亚簇主要富含生长因子，包括WNT和NF-kB通路（SFRP1和NFKBIZ），以及一些趋化因子标记（CXCL1和CCL2），而mCAF亚簇则显著积累了POSTN基因（图3b）。随后共识别出四个mCAF亚簇和六个iCAF亚簇，并发现不同亚簇的表达谱（图3b）。

一些CAF亚簇同时富集于转移性淋巴结和原发肿瘤部位，如mCAF1（MMP3+IL24+）和mCAF4，表明这些亚簇可能在促进ESCC转移中发挥关键作用（图3c）。为进一步探讨这些CAF亚簇如何促进转移，我们发现mCAF1中MMP1和MMP3的表达水平显著高于其他亚群（图3d）。MMP3可能降解基底膜和ECM，为肿瘤发生和转移提供条件。与MMP3的功能类似，p53的功能障碍可能提高MMP1表达，进而加剧肺腺癌的转移。CXCL8的表达水平在mCAF1中也明显高于其他亚簇。此外，我们发现抗血管生成基因（如HIF1A）和缺氧相关基因（如ADM）在mCAF1中表达较高（图3e）。功能分析还显示血管生成主要富含mCAF1（图3f）。通过ST和mIHC验证了mCAF1区域及相关标记基因，样本取自转移性ESCC，显示mCAF1在TME的间质区中富集（图3g，h）。mCAF1亚簇也包围了ST特征图中的促转移区域，表明mCAF1亚簇参与了ESCC转移（图3g）。本研究提出，mCAF1促进的肿瘤微环境中ECM和血管生成的降解可能促成ESCC转移。

4.SOX4和SOX11通过再生血管生成和胶原蛋白生成驱动APLN+内皮细胞趋向促进转移表型

内皮细胞是ECM的重要组成部分。3325个内皮细胞分为4个簇，包括1个动脉内皮细胞（AEC）亚簇、2个毛细血管内皮细胞（CEC）亚簇、4个血管内皮细胞（VEC）亚簇和1个淋巴内皮细胞（LEC）亚簇（图4a）。我们的发现显示，CEC亚簇中积累了与毛细血管功能（如RGCC和PLVAP）相关的基因（图4b）。我们发现CEC亚群，尤其是CEC2，在原发肿瘤样本和转移性淋巴结中占优，表明CEC2可能在ESCC转移中起关键作用（图4c）。

为了进一步探讨CEC2在转移性ESCC中的作用，我们发现APLN和APLNR在CEC2（又称APLN+内皮细胞）中表达较高（图4d）。APLN通常被视为与再生血管生成相关的重要生物标志物，可能使内皮细胞从成熟状态转变为增殖状态。此外，COL4A1和COL4A2在CEC亚簇中表达较高，尤其是在APLN+内皮细胞中，表明这些亚簇在生成胶原蛋白中起着重要作用（图4c）。胶原蛋白粘连是癌症侵袭和转移过程中发生的复杂机制，这可能是APLN+内皮细胞的潜在功能。此外，COL4A1还可能激活FAK-Src信号通路，进而促进癌症进展和转移。

随后，我们进行了SCENIC检测APLN+内皮细胞的上游转录因子，这些因子可能驱动APLN+内皮细胞形成促转移表型。SOX4和SOX11是APLN+内皮细胞中上调最显著的转录因子之一（图4f）。SOX4主要与胶原蛋白生成相关（如CXCR4、COL4A1和COL4A2），而SOX11调控与再生血管生成相关的基因（RGCC和APLN），进一步促进了内皮细胞向TME促转移表型的分化（图4e）。通过mIHC图验证了SOX4和SOX11的调控网络（图4g）。此外，ST特征图和解卷积分析结果显示，APLN+内皮细胞环绕着肿瘤细胞的促转移区域，关键标志基因的表达水平高度表达（图4h-i）。mIHC图被用来进一步验证结果，显示了ESCC中APLN+内皮细胞的促转移特性（图4j）。

5.由平滑肌细胞形成的不连续血管和由PC1（CXCL12+）激活的炎症反应促进ESCC转移

ESCC共将2191个细胞分为4个PC亚群和5个SMC亚群（图5a）。大多数SMC亚簇在转移性淋巴结中的比例显著减少，以PC1亚簇为主（图5b）。SMCs是血管的关键组成部分，对于细胞周，转移性淋巴结中PC1的比例显著较高，暗示PC1亚簇在ESCC转移中可能起作用（图5c）。我们的发现显示，CXCL12在PC1亚簇中表达较高，表明PC1可能激活转移性ESCC中的特定炎症通路（图5c，d）。接着，我们识别出一些在PC1亚簇中显著富集的通路，如IL-17信号通路、NF-κB信号通路和TNF信通路（图5e）。使用ST特征图、mIHC图以及去卷积分析结果验证（图5f–h）。

6.处于循环状态的耗尽CD8+ T细胞可能是促转移肿瘤微环境的重要组成部分

识别并分类了25816个CD8+ T细胞，分为六个亚簇（图6a）。循环和耗尽的CD8+ T细胞在肿瘤样本和转移性淋巴结中相对丰富（图6b）。我们将耗尽的CD8+ T细胞（CD8-TEX）分为两个亚组，正常状态的CD8+ T细胞（CXCL13+MKI67-）和循环状态的CD8+ T细胞（CXCL13+MKI67+）（图6c）。为了进一步探讨转移性ESCC中CD8+ T细胞的动态过渡过程，构建了CD8+ T细胞状态轨迹的拟时间图谱。该轨迹以初生CD8+ T细胞（CD8-TN）、中央记忆CD8+ T细胞（CD8-TCM）、效应记忆CD8+ T细胞（CD8-TEM）和效应CD8+ T细胞（CD8-TEMRA-TEFF）为CD8-TN与CD8-TEF之间的过渡状态，最终达到循环-CD8-TEX的最终分化状态（图6d）。我们评估了每个CD8+ T细胞亚簇的耗尽水平，表明Cycling-CD8-TEX和CD8-TEX得分最高（图6e）。免疫检查点抑制剂（ICI）被认为是癌症治疗的重要靶点，其中一些抑制性受体与T细胞耗尽相关。我们分析了5个ICI在不同CD8+ T细胞亚簇中的表达水平，发现ICI在Cycling-CD8-TEX和CD8-TEX中表达较高，表明这两个亚群的耗尽状态（图6f）。为了进一步探讨淋巴结转移的独特细胞相互作用，我们分析了正常和转移淋巴结中的细胞间差异性通讯（图6g）。与正常淋巴结相比，CD70-CD27和IL4-IL4R相互作用被显著识别，这些相互作用可能激活CD8-TEX，进而抑制肿瘤微环境。

最新研究已证明ESCC免疫细胞的独特特征。然而，尚未对ESCC中转移性和非转移性淋巴结的单细胞层面微环境进行深入研究。本研究中，我们使用了来自12名ESCC患者的29份样本，包括肿瘤样本、邻近正常组织、转移性和非转移性淋巴结，全面展示了转移性ESCC在单细胞层面微环境中的细胞和分子特征。我们构建了空间转录组图谱，并利用mIHC图像进一步探讨ESCC转移机制，验证了scRNA-seq的发现。scRNA-seq和ST的整合为开发和应用转移性ESCC的新治疗策略奠定了基础。

由于转移仍是癌症预防和治疗中的重大挑战，揭示TME的细胞和分子特性对于了解ESCC淋巴结转移情况至关重要。鉴于肿瘤细胞的固有异质性，识别与转移相关的独特上皮细胞亚群的任务极具挑战性。以往研究已识别出促进肿瘤转移的特定上皮细胞亚簇，而在ESCC15,43中尚未发现促进转移的关键亚簇。根据我们的研究，表现出促转移特征的上皮细胞在转移性淋巴结中数量丰富，这些淋巴结在ESCC中可能具有显著的转移潜力。我们的研究结果还显示，转移性淋巴结的耐药性和药物代谢功能并未显著富集，表明这些上皮细胞亚群具有促进转移的特性。在组织学层面，我们已根据促转移特征识别出转移相关区域。值得注意的是，观察到这些特定区域周围有血管，表明新血管的招募可能在ESCC转移中起关键作用。

总之，我们提供了关于ESCC转移中涉及的空间模式和不同细胞成分的独特视角和关键信息。我们已鉴定出在ESCC中表现出促进转移特性的特定上皮细胞，这些细胞可能成为转移的主要起始因子。此外，需要更多关注间质细胞，包括成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和周围细胞，因为它们可能通过调节血管生成和影响细胞外基质的形成，在促进转移中发挥关键作用。此外，最近发现肿瘤微环境中的多种免疫细胞积极促进ESCC转移。最近发现的促转移细胞成分以及肿瘤微环境中独特的细胞间通讯，将对开发转移性ESCC的有效治疗策略至关重要。

参考文献：

Guo W, Zhou B, Dou L, Guo L, Li Y, Qin J, Wang Z, Huai Q, Xue X, Li Y, Ying J, Xue Q, Gao S, He J. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics of esophageal squamous cell carcinoma with lymph node metastases. Exp Mol Med. 2025 Feb;57(1):59-71. doi: 10.1038/s12276-024-01369-x. Epub 2025 Jan 1. PMID: 39741182; PMCID: PMC11799171.