患者来源的类器官组织（PDOs）是一种个性化的癌症模型，可模仿母体肿瘤对化疗的反应，有几项研究提出将 PDOs 作为药物反应的个性化模型。PDO 可与基质细胞和免疫细胞共同培养，以再现肿瘤微环境（ TME） 的主要特征，但这如何改变 PDO 表型和药物反应机制尚不清楚。此外，PDO 对药物的敏感性通常是通过总的细胞存活率来测量的，这种方法无法解析共培养中的细胞类型特异性，也无法从机理上深入了解药物反应。
为了克服这些困难，伦敦大学学院癌症研究所的研究者利用Standard BioTools公司的质谱流式（CyTOF®）多参数，低背景，无荧光串色，数据质量高等技术优势，于前期研究中开发了一种多参数的巯基反应类有机体原位编码（TOBis）质谱流式（CyTOF®）平台，用于结直肠癌（CRC）类器官样本的研究，能够实现对类器官样本的原位混样并进行质谱流式（CyTOF®）检测，从而克服类器官研究中，组别多，样本量少，难以对翻译后修饰（PTM）信号检测的限制。[1] 而在2023年11月发表在《Cell》杂志上的《Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses》这篇文章，这个实验室进一步利用前期建立的TOBis质谱流式（CyTOF®）平台深入解析了抗癌药物如何调节 CRC PDOs 的PTM信号传导和细胞状态。[2]
图1. 用TOBis质谱流式（CyTOF®）检测类器官的细胞类型和细胞状态的实验流程。【1】
为了研究肿瘤相关成纤维细胞（CAFs） 如何调控患者特异性药物反应信号，作者建立了一个高通量三维类器官共培养系统，该系统由 10 个单独培养或与 CRC CAFs 共同培养的 CRC PDOs组成。类器官培养物一式三份，分别用5-氟尿嘧啶（5-FU）、SN-38（伊立替康的活性代谢物）、奥沙利铂和西妥昔单抗（EGFR抑制剂）、LGK974（PORCN 抑制剂）、Berzosertib（VX-970）进行处理。样本随后进行TOBis质谱流式（CyTOF®）染色和检测流程。作者设计了44个marker的CyTOF® panel，可识别细胞类型、细胞状态、DNA 损伤和 PTM 信号转导。最终作者从 2,520 个三维培养物中获得了超过 1,000 万个 PDO 细胞和超过 1,500 万个 CAFs（3,360 个细胞类型特异性的PDO+CAF单细胞信号数据集）。
图2. TOBis 质谱流式（CyTOF®）进行单细胞 PTM PDO-CAF 药物筛选的方案和流程
由于涉及到三千多个单细胞数据集的挑战，作者还开发了新的质谱流式（CyTOF®）数据分析方法Trellis，能够将处理与配对的对照样本嵌入树状结构并进行可视化。作者使用配对 Trellis 分析了 3,360 个（1,680 个 PDO、1,680 个 CAF）单细胞 PTM 图谱（>2,500 万个单细胞），探索了 PDO和 CAF的药物、患者和微环境特异性治疗反应。发现PDOs表现出明显的患者和微环境特异性药物反应，但CAF信号传导并未因患者或药物而聚集，这表明化疗主要改变了PDOs而非CAFs的细胞状态、DNA损伤和PTM图谱。
图3. Trellis：基于树状结构的单细胞治疗效果分析
图4. 对单细胞 PDO-CAF 药物反应的 Trellis 分析
(B) PDO 药物治疗特异性反应。左侧为配对组相对应的对照组，在 PHATE 1 上评估治疗效果，在 PHATE 2上评估响应机制。
(C)患者特异性药物反应解释了不同的化疗敏感机制和化疗难治性患者。
(D)CAFs可为患者提供特异性的5-FU、SN-38和奥沙利铂化疗保护。
同时，作者还利用质谱流式（CyTOF®）多参数检测的特点，能够同时对细胞的凋亡，增殖，DNA损伤等多种细胞状态进行分析，替代了传统药物筛选中单纯以细胞活死评估药效的检测方法，可以检测到不会导致细胞死亡的靶向治疗效果。分析的结果显示化疗在几乎所有 PDO 中都显示出靶向有丝分裂停滞（83%），但只有一部分患者和治疗组合会引发细胞凋亡（40%）。这表明靶向药物反应在 CRC PDO 中很常见，但往往不足以诱导细胞死亡。因此作者进一步分析了化疗敏感型和化疗难治型PDO的特征。发现与化疗敏感性患者相比，即使化疗难治性 PDO 也会出现靶向药物反应，通常引起较低的双链断裂反应，不会激活 PARP 或 Caspase-3，这意味着药物诱导的细胞抑制应激无法引发广泛的 DNA 损伤和细胞凋亡。化疗难治型PDO通常具有高水平的细胞内 pSMAD2/3、pSMAD1/5/9、pMKK4、pBAD、pBTK 和 pNF-κB 信号传导，这些通路与化疗难治型细胞状态有关。总之，TOBis质谱流式（CyTOF®）和Trellis分析显示，靶向药物活性在CRC PDO中很常见（甚至在化疗难治性PDO中），但细胞毒性是患者特异性的，与细胞内在的PDO细胞状态和PTM信号相关。
图5. PDO 药物反应机制针对特定患者，与细胞内在状态和 PTM 信号相一致
(B) 在药物治疗过程中，Trellis分析中细胞的特异性分布揭示了靶细胞状态的变化。
(E) 细胞内源性 PTM 信号转导节点的 TreEMD-PHATE 显示 PTM 在化疗难治性 PDO 中上调。
为了从功能上探索 CAFs 在患者特异性 CRC PDO 药物反应中的作用，作者对药物治疗后的 PDO 单培养物和 PDO-CAF 共培养物进行了并行 Trellis 分析；Trellis 显示，CAFs 能以患者和药物特异性的方式提供不同程度的化学保护。CAFs 可以快速调节 PDOs 中的 PTM 信号网络，并使以前对化学药物敏感的癌细胞向新的难化疗细胞命运转变。
图6. CAF对PDO 21 和 PDO 27 中的PTM 信号网络的调控。CAF 下调受保护 PDO 中的 MAPK 和 PI3K 通路，上调 SMAD、 NF-κB 和 BAD 信号转导节点。
本实验室同时间发表在《Cell》杂志上的《An oncogenic phenoscape of colonic stem cell polarization》（详见：《【Cell】-质谱流式揭示结肠干细胞极化表型》）中表明，结肠干细胞存在于一个连续的可塑性景观中，从增殖性结肠干细胞（proCSCs）到缓慢循环的复活结肠干细胞（revCSCs）。[3] 结合前期的数据结果，作者同样发现细胞间CAF信号传导能以患者特异性的方式驱动proCSC向revCSC的细胞命运转变，从而保护癌细胞免受化疗。
总之，作者利用Standard BioTools质谱流式（CyTOF®）的技术优势，开发出TOBis混样质谱流式（CyTOF®）检测平台，实现了高参数的类器官单细胞 PTM 图谱分析和基于Trellis分析方法的治疗效果分析，揭示了成千上万个PDO-CAF培养物中患者特异性的药物反应，为研究异质性药物反应机制提供了新的机会。
参考文献：
[1]Qin X, Sufi J, Vlckova P, et al. Cell-type-specific signaling networks in heterocellular organoids. Nat Methods. 2020;17(3):335-342. doi:10.1038/s41592-020-0737-8
[2]Ramos Zapatero M, Tong A, Opzoomer JW, et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 2023;186(25):5606-5619.e24. doi:10.1016/j.cell.2023.11.005
[3] Qin X, Cardoso Rodriguez F, Sufi J, Vlckova P, Claus J, Tape CJ. An oncogenic phenoscape of colonic stem cell polarization. Cell. 2023;186(25):5554-5568.e18. doi:10.1016/j.cell.2023.11.004