在生命科学研究中，蛋白质是连接基因组信息与细胞功能的核心桥梁。为了系统识别和分析生物样品中的全部蛋白质，Shotgun蛋白质鉴定成为目前应用最广泛的策略之一。该方法通过酶解后的肽段混合物直接进入质谱系统，结合DDA（Data-Dependent Acquisition）模式进行高通量采集，适用于复杂样本的全面筛查。无论是在疾病机制研究、标志物发现，还是药物靶点挖掘中，精准、高覆盖率的蛋白鉴定能力都是科研成功的关键。本文将系统介绍如何基于DDA模式开展Shotgun蛋白质鉴定，并结合实验策略和数据分析要点，助力科研人员高效获取深度蛋白组信息。

一、什么是DDA模式？

DDA（数据依赖采集）是一种基于MS1（一级质谱）强度触发MS/MS（MS2）扫描的采集模式。在DDA中，质谱仪首先对样品进行MS1全扫描，并选择强度最高的前N个母离子（通常是10~20个）进行碎裂（MS2扫描），再进入下一轮MS1采集。这一模式特别适用于复杂蛋白样品的广谱筛查，例如细胞裂解液、组织提取物等，适合进行Shotgun（散弹枪式）蛋白质组学分析，也被称为DDA模式下的 Shotgun蛋白质鉴定。

二、DDA模式下的Shotgun蛋白质鉴定流程

以下是开展DDA-Shotgun实验的典型步骤：

1、蛋白样品准备

（1）样品类型：细胞、组织、血清等复杂混合物

（2）蛋白提取：RIPA或SDS裂解，配合超声或匀浆

（3）定量：BCA、Bradford方法

（4）酶解：Trypsin酶解（一般酶解12~16小时，37°C）

（5）脱盐：用C18柱去除盐离子和杂质，提升质谱灵敏度

2、液相色谱分离（LC）

（1）使用高效纳升级反相色谱柱（如C18）

（2）梯度洗脱时间通常为60~120分钟

（3）保证肽段的充分分离，减小共洗脱现象

3、质谱采集设置（MS）

常用质谱平台如：Thermo Orbitrap系列（Fusion、Exploris、QE Plus等）、SCIEX TripleTOF系列、Bruker timsTOF。

1、优势

（1）对高丰度蛋白鉴定效果优秀

（2）技术成熟，文献广泛

（3）软件支持丰富（如MaxQuant、Proteome Discoverer）

2、局限性

（1）低丰度肽段易被忽略（由于“TopN”机制）

（2）重复性略逊于DIA（数据独立采集）

（3）扫描效率受限，信息有“丢失风险”

因此，在开展Shotgun蛋白质鉴定时，选择合适的TopN策略和仪器设置至关重要。

四、数据分析与蛋白质鉴定

DDA数据的解析依赖于数据库搜索引擎，常用工具包括：

1、MaxQuant + Andromeda

（1）支持标签和无标签定量

（2）可整合LFQ、iBAQ等定量方法

（3）强大的修改位点识别功能

2、Proteome Discoverer + Sequest HT

（1）灵活的工作流搭建

（2）与Thermo平台无缝集成

（3）可接入Percolator优化打分

3、搜索数据库建议

（1）使用Uniprot或RefSeq数据库

（2）保证物种匹配、去冗余、包含污染库（contaminants）

4、鉴定标准

（1）FDR（假发现率）控制在1%

（2）至少包含1条唯一肽段

（3）建议结合肽段覆盖率、质谱图手动验证

这些分析策略均是实现高通量Shotgun蛋白质鉴定的关键步骤。

五、提升DDA定性效果的策略

1、样品预分级：通过高pH反相分级可显著提高鉴定通量

2、动态排除优化：设置合理的排除时间，避免重复采集

3、增强富集：对于特定研究，如磷酸化蛋白，可引入IMAC或TiO₂富集步骤

4、仪器校准与维护：保持离子源状态稳定，定期清洗提升信号质量

以上策略不仅适用于DDA模式，也能广泛提升Shotgun蛋白质鉴定的整体深度和覆盖率。

六、百泰派克生物科技的质谱平台优势

在百泰派克生物科技，我们构建了以Orbitrap Exploris 480 + FAIMS Pro + nanoLC为核心的蛋白质组学平台，专注提供：

• 高深度的Shotgun蛋白质鉴定服务（>7000个蛋白/样本）
• 个性化参数优化（根据样品特性调整TopN、碎裂能等）
• 支持磷酸化、乙酰化等多种修饰分析
• 提供中英文数据报告和科研图表支持

我们已为数百家科研单位和生物医药企业提供定制化蛋白质组学服务，助力基础研究与转化医学。

尽管近年来DIA和PRM等新技术日益兴起，但DDA仍以其成熟度、数据质量和广泛适用性，被广泛用于基础科学和生物医药研究。掌握DDA模式下的Shotgun蛋白质鉴定策略，是开启蛋白质组学研究之门的关键一步。如果你正在规划蛋白质组学实验，欢迎咨询百泰派克生物科技，我们将根据研究目标和样品特点，为您量身定制最合适的质谱解决方案。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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