聚乙二醇主链ELISA试剂盒使用说明书
用于测量聚乙二醇和聚乙二醇结合蛋白的ELISA试剂盒在使用操作ELISA试剂盒之前，请务必先彻读以下介绍。
使用目的：该试剂盒仅供科研用途使用。任何情况下都不得用于治疗或诊断用途
介绍：生物制品通过与聚乙二醇结合，延缓了蛋白质降解，降低了被循环系统清除的速率，从而延长了半衰期（参考文献1）。聚乙二醇结合蛋白的药物动力学通常使用特异性检测蛋白质含量来评估确认。该方法不仅耗时，而且需要开发昂贵的针对目标蛋白质的酶联免疫吸附检测方法（ELISA）。由Life Diagnostics生产的聚乙二醇 ELISA 试剂盒，可以测量聚乙二醇结合蛋白中的聚乙二醇部分，因此适合一些列聚乙二醇结合蛋白的药物动力学评估。
背景：检测方法为直接竞争性ELISA法。 BSA (牛血清白蛋白) 与甲氧基聚乙二醇单链通过共价键结合，涂布在96孔板的微孔中。经稀释的样品和含有聚乙二醇结合蛋白的标准溶(50µl) 加入微孔中。然后将辣根过氧化酶结合抗-PEG抗体（50μl）添加到孔中，并将孔板在孔板振荡器上培养1小时。洗涤微孔后，将 TMB (100 µl HRP酶底物), 添加到孔中培养20分钟, 形成蓝色。加入1N盐酸 (100 µl)停止显色，此时溶液颜色转为黄色，测定450nm处的吸光度。如果样品中存在聚乙二醇，会和板上固化的聚乙二醇争夺与HRP结合抗聚乙二醇抗体的结合，从而导致吸光度值下降。 ELISA试剂盒中使用的抗体是由Life Diagnostics 开发的小鼠单克隆抗体 (clone 1D9-6) ，对聚乙二醇主链具有特异性。Life Diagnostics的研究表明该试剂盒可用于检测包含一条或多条的聚乙二醇链的蛋白质，也可以检测未结合的聚乙二醇。 灵敏度随着聚乙二醇链长和聚合度的不同而变化 （参见表1），因此推荐生成一条标准曲线，用于检测不同的聚乙二醇或聚乙二醇结合分子。试剂盒提供的标准品，是结合了单条20kDa甲氧基聚乙二醇链的BSA. 因此终端用户可以籍此确认试剂盒的性能。
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PEG
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EC50 (ng/ml)
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BSA-(mPEG 20 kDa)3-7
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1.0 +/- 0.1
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BSA-mPEG 20 kDa
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3.6 +/- 0.5
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BSA-PEG 10 kDa
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9.4 +/- 1.1
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BSA-mPEG 5 kDa
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111 +/- 22
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20 kDa mPEG
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0.70 +/- 0.15
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10 kDa PEG
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0.59 +/- 0.16
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5 kDa mPEG
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4.65 +/- 2.32
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表1. 高灵敏度聚乙二醇ELISA试剂盒中聚乙二醇结合BSA和未结合聚乙二醇的特征值。 请注意聚乙二醇结合BSA的浓度仅指多肽部分，而不包括由聚乙二醇引入的物质。EC50值指的是由3-6次检测得到的 +/- SD的平均值。
储存： 收到HRP抗聚乙二醇抗体小瓶后，聚乙二醇结合BSA标准品和PEG涂布的96孔板应即刻置于-20℃的冷冻箱中保存直至使用。请勿置于更低的温度下保存。试剂盒的其余组成应置于2-8℃的冰箱中保存。微量检测条应置于包含干燥剂的密封袋中保存，以尽可能避免潮湿空气影响。如试剂盒部件按上述方法妥善保存，测试试剂盒自购买之日起，保持稳定6个月。在使用前，孔板，稀释剂和TMB试剂应平衡至室温，这点很重要。
物料
试剂盒提供的物料：
- 涂布聚乙二醇的 Microtiter 96孔板 (12 条8孔可拆卸板条)。-20℃下保存。
- HRP结合抗聚乙二醇抗体, 1 小瓶。 -20℃下保存。
- HRP结合聚乙二醇稀释剂, 50 ml
- PEG-BSA标准品, 1小瓶。* -20℃下保存。
- HRP PEG洗涤缓冲液 (20x stock), 50 ml
- TMB试剂, 11 ml
- 终止液, 11 ml
需要用到但试剂盒未包含的物料：
- 精密移液器和吸头
- 蒸馏水或去离子水
- 聚丙烯管或玻璃管
- 漩涡混合器
- 吸水纸或纸巾
- 微孔板培养箱/振荡筛 (混合速率 ~150 rpm)
- 洗板机
- 读板器，450nm下光密度范围0-4
- 绘图软件
试剂盒标准品的制备
- 将8个聚丙烯管或玻璃管分别标记为1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064 和0 ng/ml。
- 按照PEG标准品小瓶标签上的方法制备1000 ng/ml标准溶液。
- 分别将200μl稀释液加入标有200、40、8、1.6、0.32、0.064和0 ng/ml的试管中。
- 将1000 ng/ml的PEG标准溶液用移液器转移50 μl转移至标有200 ng/ml的试管中并混合均匀。由此获得 200 ng/ml PEG-BSA 工作标准溶液。
- 依次进行类似的5倍稀释可分别制备40, 8, 1.6, 0.32 和 0.064 ng/ml的标准溶液。
样品制备
聚乙二醇结合蛋白在血清或血浆里的浓度与许多因素有关：注射途径，注射量，注射后收集血清或血浆的时间。由于这些变量都是由用户确定的，因此需要根据经验来确定最佳的稀释程度。
HRP 结合抗-PEG抗体制备
确定所需结合物的体积 (0.5 ml 每 8个孔板条带) ，然后按小瓶标签标示使用稀释溶液稀释HRP结合抗-PEG抗体。制备后应尽快使用。
洗涤溶液制备
洗涤溶液是以20倍贮存液的形式提供。使用950毫升蒸馏水或去离子水稀释瓶内容物（50毫升）。
分析过程
- 确保涂布板孔的数量足够用。
- 将50μl标准品和样品加入孔内（建议标准品和样品一式三份进行测试）。
- 向每个孔中加入50μl的HRP结合抗-PEG抗体。
- 在室温（25°C）下，以150转/分的速率在微型平板振动筛上培养1小时。
- 使用洗板机，用400μl清洗缓冲液清洗板孔共6次。
- 用吸水纸或纸巾充分擦拭板孔，以去除残留液滴。
- 将100μl TMB试剂加入各个板孔。
- 以150转/分的转速在微板振动筛上轻轻混合20分钟。
- 加入100μl终止溶液到每个板孔，来停止反应。
- 轻轻混合，直到所有蓝色变成黄色。
- 在5分钟内用孔板读数器读取450 nm处的吸光度。
结果计算
使用计算机图形软件用于结果计算。
- 计算每组参考标准品和样品的吸光度平均值(A450)。
- 通过测得的每个参考标准品的平均吸光度，与其浓度以10为底的对数log10（ng/ml）的比值，绘制标准曲线，垂直轴或Y轴为吸光度，水平轴或X轴为浓度。
- 将数据拟合到Sigmoidal函数量效关系模型（可变斜率）。曲线上限可以用0 ng/ml空白标准品测定值修正，曲线下限可以用1000 ng/ml标准品的测定值修正。
- 根据每个样品的平均吸光度值，从标准曲线中得到相应聚乙二醇化蛋白质以10为底的对数浓度，并通过逆以10为底对数计算得出浓度（ng/ml）。
- 强烈建议仅使用标准曲线中间50%范围内的样品吸光度值来确定PEG浓度。例如，如果吸光度的下限（0 ng/ml）和上限值分别为1.6和0.1，则仅采用位于1.225和0.475范围内的样品吸光度值。
- 用推导出的浓度乘以稀释因子，以确定血清/血浆样本中聚乙二醇化蛋白质的实际浓度。
- 如果样品的A450值超出标准曲线的有效范围，则应适当稀释样品并重新测试。
典型标准曲线
下面显示了一个典型的标准曲线，在Y轴上的在450nm的吸光度读数，在X轴上为 20 kDa BSA-甲氧基聚乙二醇的浓度。请注意，X轴是以10为底的对数刻度。
峰值/回收率数据
Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）血清加入了所示浓度的20 kDa BSA-甲氧基聚乙二醇，回收率则使用PEG-ELISA P-0003进行估算。
发现正常大鼠血清中含有可测量的聚乙二醇，可能来自膳食来源。
重要提示
- 切勿将叠氮化物作为防腐剂添加到血清或血浆样本中。叠氮化物是HRP的抑制剂，会使分析无效。
推荐使用洗板机用于微孔板清洗。仅使用试剂盒提供的清洗缓冲液。在使用前用蒸馏水或去离子水洗涤洗板机所有的管道和器皿，并用清洗缓冲液彻底洗涤。 - 制备标准品时，通常使用多道移液器在空白聚丙烯96孔板上进行恰当的连续稀释操作。样品也同样制备，并/或分配到空白96孔板用于酶联免疫的位置。这样使用多道移液器可保样品和标准品快速简便地转移到酶联板上。
- 如使用试剂盒之外的标准品，建议使用10倍稀释液来确定标准曲线范围，从10 μg/ml浓度开始。 使用单条8孔板条，可毫不费力地确定从0.1 ng/ml到10 μg/ml 浓度范围。然后通过微调获得可用的标准曲线范围。
- 所有试剂在使用前必须达到室温（18-25摄氏度）。
- 在添加HRP结合抗PEG抗体之前，始终先将样品和标准品添加到微孔中。
- 请勿使用自备缓冲液替代试剂盒提供的缓冲液（例如稀释液或洗涤缓冲液）。许多市售材料含有聚乙二醇或聚乙二醇结合分子，这将影响试剂盒的性能。因此，应小心选择用于聚乙二醇结合蛋白研究的其他组份。
- 吐温-20是一种含有聚乙二醇的洗涤剂，常用于ELISA稀释和洗涤缓冲液。它会干扰本酶联免疫吸附试验盒。其他聚乙二醇洗涤剂亦如是。
- 不要把叠氮化物作为防腐剂添加到血清或血浆样本中。叠氮化物是HRP的抑制剂，会使分析无效。
- 强烈推荐使用洗板机清洗微孔。务必使用试剂盒附带的清洗缓冲液。使用前用蒸馏水或去离子水清洗洗板机的所有管路和容器，并用清洗缓冲液彻底清洗洗板机。
- 制备标准品时，通常使用多道移液器在空白PS 96孔板中进行适当的连续稀释。样品制备和/或分配到在ELISA中预置的空白96孔板中。使用多道移液器将样品和标准品快速简便地转移到ELISA板上。
- 如采用试剂盒预置以外的标准品，建议使用10倍稀释液来确定标准曲线范围，起始浓度从10μg/ml开始。使用单个8孔板条，浓度范围0.1 ng/ml至10μg/ml的检测会更便宜些。然后再微调标准曲线范围。
参考文献
1. Webster R, et al. PEGylated Proteins: Evaluation of their safety in the absence of definitive metabolism studies. Drug Metabolism and Disposition 35:9-16 (2007)