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基因甲基化检测

作者:上海捷兰生物技术有限公司 2008-10-22T00:00 (访问量:3798)

简介:甲基化检测主要包括MSP和BSP,以及QMSP.基因启动子甲基化检测在临床诊断、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值,所以目前是一项比较热门的研究手段。

基因甲基化检测

         使用美国AB公司的9700 PCR System为主的多种PCR装置。

原理与应用

基化是在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基,在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中,是最早发现的修 饰途径之一,是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分。大量研究表明,DNA甲基化不改变DNA的一级结构,但是能引起染色质结构、DNA 构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而在基因的表达及其调控、DNA的复制、细胞的生长发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾病 (如发育畸形、癌症、心血管疾病、糖尿病和神经心理失调等)发生过程中发挥重要作用。

        DNA的甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶和少量的N6- 甲基腺嘌呤及7-甲基鸟嘌呤。在高等生物中,5-甲基胞嘧啶多发于CpG二核苷酸序列中,基因组中60%-90%CpG是甲基化的。在甲基转移酶 (DNMT)的催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基,使CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。由于甲基化胞嘧啶极易在进 化中丢失,高等真核生物中CpG序列远远低于其理论值,但在基因组的某些区域中,通常是基因的启动子和第一外显子区CpG序列密度很高,可以达均值的5倍以上,成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区,形成所谓的CpG。哺乳类基因组中约存在4万个CpG岛,大多位于转录单元的5’区。CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象,而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。因此,基因启动子甲基化检测在临床诊断药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。

■ 服务项目

◇ BSP分析     ◇ Msp分析     ◇ QMSP分析 

■ 检测方法

亚硫酸盐修饰克隆测序法,巢式PCR法,荧光定量PCR法

■ Real Time PCR装置

使用美国ABI公司的9700 PCR仪和Step-one PLUS System为主的PCR装置。

服务项目说明

亚硫酸盐测序法 (bisulfite sequencing PCR, BSP)

        先抽提基因组DNA,再进行亚硫酸盐修饰,甲基化PCR后装克隆,通过最后对PCR产物进行克隆测序,可以得到目的片段中每个CG位点的甲基化情况,这种方法更加准确,所以目前BSP法受到更多研究者的青睐!

最后通过对测序结果分析, 可以得到如下数据:

  • 测序序列与目的序列的相似度(%
  • C-T转化效率(%
  • 目的序列中每个CG的甲基化情况(点状图)
  • 目的序列中每个CG的甲基化比例(%

                                                     序列比对

■ 甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR,MSP)

        甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法.MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为 尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳分析,确定与引物互 补的DNA序列的甲基化状态。

■ QMSP分析

            QMSP采用荧光定量的方法,可确切定量出甲基化的比例。详情请电联我们的技术服务人员。

 

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