乳腺癌已成为全球范围内最常见的恶性肿瘤，占女性癌症的近30%。由于治疗手段的快速发展，大多数非转移性乳腺癌患者是可以治愈的。腋窝淋巴结状态是决定治疗策略的重要临床因素，在风险评估和预后评估中也具有重要意义。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一个强大的工具，可以在单个细胞的分辨率下提供人类癌症的表达谱。空间转录组学（ST）是一种新型的生物技术，可以在组织切片中以空间分辨率进行可视化和定量分析，弥补scRNA-seq中空间信息的不足。ST结合scRNA-seq有助于克服scRNA-seq（缺乏空间信息）和ST（不是单个细胞分辨率）的局限性。

单细胞转录组测序，空间转录组测序

本研究利用单细胞RNA测序（ scRNA-seq ）和空间转录组学技术对4例乳腺癌患者及其配对的腋窝转移淋巴结的65，968个细胞进行了分析。鉴定了一个具有高水平氧化磷酸化（OXPHOS）的播散性癌细胞簇。研究发现，当扩散启动时，糖酵解和OXPHOS之间会发生转变。此外，这种独特的细胞簇沿肿瘤前缘分布，后续对发现进行了验证。

1. 乳腺癌原发灶和淋巴结转移灶单细胞图谱

为了全面鉴定原发肿瘤和淋巴结转移肿瘤中的细胞组成和结构，本研究对4例患者手术切除的4对原发浸润性乳腺肿瘤和转移腋窝淋巴结进行了scRNA-seq（10x Genomics）。通过严格的质量过滤，对剩余的65，968个细胞进行了单细胞图谱的构建。通过聚类，所有的细胞被分为了0-15个cluster（图1B），通过marker基因将所有细胞分为8种细胞类型，包括上皮细胞（ECAM1、KRT19、PROM1）、浆细胞（IGHG1、MZB1、SDC1）、髓系细胞（CD68、CD163、CSF1R、MRC1、TPSAB1、MS4A2、CD1C）、 NK细胞（NCR1、GLNY、NKG7）、B细胞（CD79A、CD79B、MS4A1）、T细胞（CD3D、CD3E、CD8A、CD4）、成纤维细胞（COL1A1、COL1A2、DCN）、内皮细胞（PCAM1、VWF）（图1C、D）。

2. 通过scRNA-seq鉴定上皮细胞特征

由于癌细胞来源于上皮细胞，本研究对上皮细胞细分为了11个亚群。为了区分恶性细胞和非恶性细胞，本研究对于上皮细胞和上皮细胞亚群进行了CNV水平的评估。在所有上皮细胞簇中，C3的CNV水平明显低于其他细胞簇，表明C3是一组正常的乳腺导管上皮细胞，而其他细胞簇是恶性上皮细胞（图2B）。为了解析乳腺癌上皮细胞的进化动态，对上皮细胞的11个cluster进行了拟时序分析。因为C3为非恶行细胞，且在轨迹曲线的右下角，证明拟时序分析的右下角为起点。因此，C2、4和9被鉴定为早期扩散的癌细胞（EDC）簇，因为它们位于轨迹曲线的末端，具有相对较高的CNV水平（图2B、C）。更重要的是这三群在原发肿瘤和淋巴结样本中均有出现。尽管C8的CNV水平较低，但因为其在原发肿瘤和淋巴结样本中均有出现，也被定义为EDC簇。总之，研究确定了C3代表正常乳腺导管上皮细胞，而C2、4、8和9是乳腺癌的EDC簇。

为了研究EDC簇（C2 ， 4 ， 8 ， 9）的基因表达变化，基于分子特征数据库（Molecular Signatures Database，MsigDB）的Hallmarker基因集进行富集分析，以识别癌细胞在传播过程中的变化途径。富集程度最高的通路包括与细胞增殖相关的通路（mTORC1 signaling、MYC targets V1）和乳腺癌治疗反应相关的通路（estrogen response early， estrogen response late），这些通路与患者的临床病理特征和EDC簇更多的恶性特征相符。另外，EDC簇显示OXPHOS途径的显著富集，暗示扩散细胞的新的代谢特征（图2D）。

热图（图2E）显示了细胞分化过程中基因表达变化。其中在恶性上皮细胞早期播散过程中，OXPHOS （COX6C、DHRS2、ATP5MC2和NDUFB4）中的标记基因呈现先上调后下调的表达模式，而糖酵解途径中的标记基因（GAPDH、LDHA、PKM和PGK1）呈现先下调后上调的表达模式。同时，与细胞粘附和迁移相关的基因（CLDN3， F11R）的表达也呈现先下降后上升的模式，这表明了癌细胞在扩散过程中细胞行为的动态变化。乳腺癌细胞的这种代谢转换类似于转移过程中上皮间质转化（EMT）的变化，即从原发肿瘤脱离后，EDCs的代谢轮廓从糖酵解转变为OXPHOS。一旦转移细胞形成，代谢偏好又恢复为促进细胞增殖。总之，我们的研究结果揭示了乳腺癌早期转移过程中OXPHOS和糖酵解之间的转变，表明OXPHOS可能在转移过程中发挥重要作用。

3. 细胞通讯分析揭示EDCs与免疫细胞之间的细胞间配体-受体对

为了鉴定EDC与免疫细胞之间的相互作用关系，本研究对EDC和免疫细胞做了cellchat分析。虽然在原发肿瘤中主要细胞类型之间的相互作用数量较高，但两组之间的相互作用强度非常接近（图3A）。EDC簇在原发肿瘤中表现出与免疫细胞更多的相互作用，而在淋巴结中表现出与免疫细胞更强的相互作用（图3B-E）。

接下来研究了不同细胞簇之间的特异性配体-受体相互作用。免疫细胞之间的配体-受体对（CD22 - PTPRC、PTPRC - CD22和ADGRE5 - CD55）在淋巴结相比于原发肿瘤中显著上调，表明这些途径对于肿瘤的免疫反应至关重要。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）通路在EDCs和免疫细胞之间的淋巴结和原发肿瘤中都很活跃，表明它在这两个部位都是必不可少的，并且可能有助于乳腺癌的传播（图3F-H）。20条通路中，有4条通路在原发和转移中都活跃，其他的一些通路分别存在淋巴结或者原发肿瘤中（图3I）。

5. 敲除COX6C和DHRS2可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和EMT评分

使用不同的人乳腺癌细胞系敲除了氧化磷酸化通路中的关键基因COX6C和DHRS2基因，并结合transwell细胞迁移实验、免疫组化（IHC）、WB实验等，发现敲除COX6C和DHRS2可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和EMT评分。

6. Oxphos的上调与乳腺癌患者的淋巴结状态和预后相关

作者接下来用自己的FUSCC队列数据和TCGA数据库相结合分析，发现淋巴结转移阳性样本在OXPHOS通路上得分更高，在糖酵解途径得分更低。scRNA-seq公共数据集分析验证发现OXPHOS通路、雌激素信号通路和tight junction通路在EDC细胞中富集。TCGA生存分析发现，在HER2阳性乳腺癌中和基底样乳腺癌中，COX6C和DHRS2与较差的OS（overall survival）和DMFS（distant metastasis-free survival）相关。