编者按
淫羊藿(Epimedii Folium)是中国传统中药, 具有很高的药用价值，可用于类风湿关节炎、骨质疏松、白癜风、肿瘤、生殖及免疫系统疾病等研究与临床治疗。
通过斑马鱼模型，研究人员可以全面、快速地评估淫羊藿的活性成分、药效、毒性及代谢过程，为淫羊藿的深入研究和开发提供了有力的支持。本期我们分享近期发表的几篇基于斑马鱼模型开展中药淫羊藿研究的最新成果~~~
01、利用斑马鱼等揭示治疗白癜风常用中药淫羊藿促进色素合成作用的分子机制和药效物质
文章题目
Epimedin B exhibits pigmentation by increasing tyrosinase family proteins expression, activity, and stability
杂志：Journal of Pharmaceutical Analysis（IF=8.8）
发表时间：2024年1月
作者：李医明、吴华丽团队
单位：上海中医药大学中药学院等
文章主题：
近年来，白癜风的临床治疗主要集中在抑制自身免疫反应和促进色素合成两方面。中药淫羊藿中的主要活性成分朝霍定B（EB）在免疫调节方面已有报道，而对黑素细胞的色素合成过程的影响尚未研究报道。
因此，研究团队对EB促进色素合成的过程进行了系统性的体内外探讨，包括细胞模型（黑色素瘤细胞、人原代黑色素细胞）、人皮肤组织培养模型、模式动物斑马鱼色素脱失模型和C57BL/6小鼠色素脱失模型等。首先确定了朝藿定B（EB）是淫羊藿提取物中含量高、活性强、毒性低的主要活性成份，并在细胞、组织、斑马鱼、小鼠多层面对EB体内外调控色素方面进行深入系统的研究。
采用RNA-Sequencing、激光共聚焦、CO-IP和Proximity Ligation Assay（PLA）邻位连接等实验手段阐明EB通过增加酪氨酸酶（TYRs）转录翻译和促进TYR活性；同时EB可以逆转TYR和TYRP1（大约60 kDa）的泛素化-蛋白酶体的降解过程，而对DCT没有影响，从而达到增强TYRs蛋白的稳定性多种分子机制来发挥作用。
该研究首次对EB在色素合成药理活性进行了探究，并通过体内外多种色素脱失模型上评估EB色素合成作用，发现EB从表达、活性和稳定性三方面靶向TYRs，从而发挥色素合成作用，从而初步阐明了临床治疗白癜风常用中药淫羊藿促进色素合成作用的分子机制和药效物质基础。这一研究成果从分子水平揭示淫羊藿临床治疗白癜风的药效物质基础，为白癜风的新药开发奠定基础。
图1 EB可靶向TYRs发挥色素合成作用
02、基于斑马鱼揭示中药复方强心饮防治肾上腺素诱导心肌肥厚机制
文章题目
Qiangxinyin formula protects against isoproterenol- induced cardiac hypertrophy
杂志：Phytomedicine (IF=6.7)
发表时间：2024年4月
作者：周忠焱、马杰、唐靖一、汪玉等
单位：上海中医药大学附属龙华医院、香港大学等
文章主题：
心肌肥厚和炎症、心纤维化同属于心肌梗死性心力衰竭（HF）的重要特征，心血管疾病是目前老龄化死亡的主要原因，心力衰竭属于其中最典型的一种高度危及生命的心血管疾病。中药复方强心饮（QXY），源自《伤寒论》中所记载的真武汤，由附子、白术、淫羊藿、猪苓、补骨脂、白芍、川芎、茯苓、鹿角9种中药组成，已有实验证明QXY抑制氧化应激和心肌细胞的凋亡，改善慢性心力衰竭患者的心功能状况。
本研究通过多组学分析研究，探究中药复方强心饮的组方中成分表征和药效验证。使用UHPLC-MS将QXY的化学成分量化，运用斑马鱼建立异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌肥大模型，验证QXY显著治疗心功能障碍和损伤的作用及作用机制。结果发现强心饮中含有乌头原碱（BMA）、白术内酯I（ATL I）、淫羊藿苷（ICA）、槲皮素（QUE）、补骨脂素（PRN）、山奈酚（KMP）、阿魏酸（FA）、原儿茶酸（PCA）等多种活性成分，其中淫羊藿苷（ICA）、补骨脂素（PRN）和阿魏酸(FA)的含量尤为丰富。
在斑马鱼模型上，发现强心饮显著缓解ISO引起的心肌损伤指标BNP、CKMB、CTNT2升高，并且转录组数据提示其作用机制与钙离子信号有关。在大鼠心肌细胞H9c2模型上，强心饮能够增加SMAD2和MYPT1的磷酸化表达，抑制MLC的磷酸化表达，并阻断钙内流、减少细胞内脂质过氧化产物MDA、刺激ATP的产生、增加线粒体膜电位，从而抑制ISO诱导的心肌细胞肥大。
图2 QXY对ISO诱导的斑马鱼心肌肥大及改善心脏损伤标志物的mRNA表达水平
03、基于斑马鱼评价箭叶淫羊藿的代谢-效/毒作用
文章题目
基于斑马鱼M-Act/Tox联合评价箭叶淫羊藿的代谢-效/毒作用
杂志：中草药（北大核心期刊，2019年第7期）
发表时间：2019年4月
作者：葛静、凌洁、宁青、刘欣欣、宋捷、韦英杰、贾晓斌
单位：南京中医药大学第三临床医学院、江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药释药系统重点研究室、中国药科大学中药学院
文章主题：
针对现有体内、外模型无法进行M-Act/Tox联合的在体、高效筛选的技术瓶颈，本课题组依据斑马鱼的遗传发育与哺乳动物高度相似的特点及优势，参考前期相关研究及国内外文献，提出斑马鱼代谢模型、骨质疏松模型及毒性评价法有机整合，可建立M-Act/Tox联合的抗骨质疏松中药高效筛选法。对实现兼顾有效性与安全性，实现条件简单、高效率、低成本、高灵敏地进行中药在体M-Act/Tox联合评价具有重要意义。本研究采用提出的斑马鱼M-Act/Tox联合法，评价箭叶淫羊藿的安全性、抗骨质疏松有效性及代谢特性，以期为深入研究其毒/效物质基础提供参考。
斑马鱼毒性评价发现，箭叶淫羊藿在500 μg/mL及以上质量浓度时致斑马鱼中毒（脏器变形或死亡），毒性与给药质量浓度和时间相关。泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型评价发现，低质量浓度箭叶淫羊藿（6.25、12.50、25.00 μg/mL）具有明显的抗泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失作用，而在较高质量浓度（100、200 μg/mL）时抗骨质疏松作用则受到抑制，这为安全、有效地使用淫羊藿提供参考。
斑马鱼代谢实验发现，箭叶淫羊藿中主要多糖基黄酮成分EA、EB、EC和淫羊藿苷经斑马鱼作用24 h后，全部脱糖基转化为含有2个鼠李糖基的SC和1个鼠李糖基的BI，而SC和BI相对稳定，提示代谢物可能是潜在致毒/致效的关键因素，在前期研究中发现多糖苷EA、EB和淫羊藿苷对斑马鱼的毒性小，以淫羊藿苷为代表，发现其给予斑马鱼后动态转化为BI，但未见斑马鱼产生毒性；而EC给予斑马鱼后，动态转化为箭藿苷C后毒性增加。本研究亦提示斑马鱼的效应/毒性评价是基于代谢转化的在体过程。
斑马鱼M-Act/Tox联合评价法突破了现有体内、外模型无法兼顾三者在体与高效评价的技术瓶颈，具有样品用量小、劳动强度小、高效率、低成本、在体化、微板化等优点，为高效辩识壮骨中药的M-Act/Tox提供思路与方法。
图3 斑马鱼幼鱼(8 dpf)头骨茜素红染色显微成像图(X100)
04、基于斑马鱼构建抗骨质疏松的小分子药物筛选模型
文章题目
Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis
chemical screening
杂志：Animal Models and Experimental Medicine (AMEM)
发表时间：2018年4月19日
作者：张晶晶、黄洪新等
单位：广东医科大学附属医院等
文章主题：
本研究利用成骨细胞表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼Tg(ola.sp7:nlsGFP)，结合经典的糖皮质激素地塞米松（dexamethasone，Dex）诱导方法建立了骨质疏松斑马鱼模型的研究成果。通过检测成骨细胞绿色荧光蛋白eGFP的信号面积与强度，来反映骨矿化面积及骨密度情况，并与传统化学染色方法进行了对比。结果证明，利用转基因斑马鱼品系构建的骨质疏松模型来间接反映成骨细胞密度等的方法便捷、可行、有效，与传统斑马鱼骨骼化学染色方法相比，更加稳定、省时、高效，可作为抗骨质疏松药物高通量筛选模型。
利用淫羊藿黄酮等治疗诱导的骨质疏松斑马鱼后，成骨细胞密度等得到拯救恢复。进一步基因水平的研究表明，糖皮质激素诱导斑马鱼骨质疏松模型主要由于其抑制了成骨细胞相关因子osterix, osteocalcin和 osteopontin的表达，上调了破骨细胞相关基因tartrate-resistant acid phosphatase等的表达。而淫羊藿黄酮的治疗能重新拯救恢复osterix, osteocalcin和 osteopontin等的表达水平。
该项研究成果以转基因斑马鱼为工具，结合经典的骨质疏松动物模型构建方法，为抗骨质疏松药物分子的高通量筛选和骨质疏松病理机制的研究提供了便捷、可靠的动物研究模型。
图4 构建斑马鱼骨质疏松模型
05、淫羊藿及其制剂主要化学成分与肝损伤作用研究进展
文章题目
淫羊藿及其制剂主要化学成分与肝损伤作用研究进展
杂志：中草药（北大核心期刊，2023年第21期）
发表时间：2023年11月
作者：张悦，王佳艺，刘慧敏，殷宏庆，宋丽丽，李遇伯等
单位：天津中医药大学中药学院等
文章主题：
近年来，有关淫羊藿及其复方制剂致肝损伤或引起不良反应的报道逐年增多。本文通过对淫羊藿及其2种制剂的化学成分及肝损伤研究进行全面归纳总结，为淫羊藿及其相关制剂的安全性研究提供参考，同时为其临床安全用药提供思路和支持。
以箭藿苷B为例，目前的研究表明，箭藿苷B可导致斑马鱼胚胎卵黄囊肿胀和吸收延迟，存在发育毒性，并且在低浓度的条件下仍可引起成年斑马鱼细胞坏死，中度水肿及轻度空泡改变，但是对于其毒性作用的机制还未有研究进行详细的阐明。
多项研究证明，淫羊藿、壮骨关节丸和仙灵骨葆胶囊长时间大量给药后，可引发肝损伤，其相关的毒性机制可能与胆汁酸代谢受阻、肝细胞凋亡及铁死亡、细胞结构受损，氧化应激增加等生物学过程相关。环特生物郭胜亚等基于斑马鱼评价壮骨关节丸的肝脏毒性，结果表明壮骨关节丸导致斑马鱼卵黄囊吸收延迟，诱发斑马鱼肝脏毒性。时克等用斑马鱼毒/效同步法评价壮骨关节丸对健康鱼和骨质疏松模型鱼的毒性作用，结果显示，壮骨关节丸对模型斑马鱼的毒性更强。并且有多项研究表明，淫羊藿中黄酮类成分朝藿定C的代谢产物为箭藿苷C，箭藿苷C的动态增加与淫羊藿毒性产生密切相关。
除固有毒性成分引发肝损伤外，以激活NLRP3炎症小体活性的淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II还可以诱发特异质肝损伤。研究表明，脂多糖可刺激机体产生免疫反应，在免疫激活的状态下，淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II可促进NLRP3炎症小体活化，导致促炎因子的释放、细胞焦亡的发生，从而诱发特异质肝损伤。
为减少肝损伤事件的发生，使淫羊藿及其制剂更合理、更安全的应用于临床，进一步对以上2种形式的肝损伤进行总结，见图5。首先需要警惕由长期、大剂量用药造成的固有肝毒性。其次，处于免疫应激状态下的患者，为淫羊藿及其制剂致肝毒性的主要易感人群，此类患者应尽量避免使用淫羊藿及其制剂，降低特异质肝毒性发生的风险。
图5 淫羊藿及其复方制剂引起肝损伤推断图
作为健康美丽产业CRO服务开拓者与引领者、斑马鱼生物技术的全球领导者，环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”四位一体的综合技术服务体系，开展健康美丽CRO服务、科研服务、智慧实验室搭建三大业务。目前，环特已建立200多种斑马鱼模型及脑类器官、心脏类器官及各种肿瘤类器官培养平台，欢迎有需要的读者垂询！17364531293（微信同号）